一、目的

淀粉一般都是直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物。直鏈淀粉和支鏈淀粉含量和比例因植物種類而不同，決定著谷物種子的出飯率和食味品質(zhì)，并影響著谷物的貯藏加工。通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)掌握雙波長測定谷物中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。

二、原理

根據(jù)雙波長比色原理，如果溶液中某溶質(zhì)在兩個(gè)波長下均有吸收，則兩個(gè)波長的吸收差值與溶質(zhì)濃度成正比。

直鏈淀粉與碘作用產(chǎn)生純藍(lán)色，支鏈淀粉與碘作用生成紫紅色。如果用兩種淀粉的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與碘反應(yīng)，然后在同一個(gè)坐標(biāo)系里進(jìn)行掃描（ 400 - 960 mm） 或做吸收曲線，可以得到圖所示結(jié)果。

圖 作圖法選擇淀粉的測定波長

圖中 1 為直鏈淀粉的吸收曲線， 2 為支鏈淀粉的吸收曲線。對含有直鏈淀粉和支鏈淀粉的未知樣品，與碘顯色后，只要在選定的波長λ1 ，λ 2 ， λ 3 ，λ 4 ，處作 4 次比色，利用直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線即可分別求出樣品中兩類淀粉的含量。

三、儀器、試劑和材料

1. 儀器

（1） 電子分析天平

（2 ）索氏脂肪抽提器 1 套

（3 ）美析儀器分光光度計(jì) 1 臺

（4 ） pH 計(jì)

（5 ）容量瓶 100ml X 2 ， 50ml X 16

（6 ）吸管 0.5ml X 1， 2ml X 1， 5ml X 1

2. 試劑

（ 1） Ether或石油醚（沸程 30-60 ℃）

（2 ）無水乙醇

（ 3 ） 0.5 ml / L KOH 溶液

（ 4 ） 0.1 mol / L HCl 溶液

（5） 碘試劑：稱取碘化鉀 2.0g， 溶于少量蒸餾水，再加碘 0.2g， 待溶解后用蒸餾水稀釋定容至 l00ml.

（6） 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液：稱取直鏈淀粉純品 0.1000g， 放在 100ml 容量瓶中，加入 0.5mol/ L KOH 10ml， 在熱水中待溶解后，取出加蒸餾水定容至 100ml， 即為 1mg/ml 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（7） 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液：用 0.1000g 支鏈淀粉按 （6） 法制備成 1mg/ml 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3. 材料

供試谷物粉。

四、操作步驟

1 .選擇直鏈、支鏈淀粉測定波長、參比波長。

直鏈淀粉：取 1mg/ml 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液 1ml， 放入 50ml 容量瓶中，加蒸餾水 30ml， 以 0.1 mol/ L HCl 溶液調(diào)至 pH 3.5 左右，加入碘試劑 0.5ml， 并以蒸餾水定容。靜置 20min ，以蒸餾水為空白，用雙光束分光光度計(jì)進(jìn)行可見光全波段掃描或用普通比色法繪出直鏈淀粉吸收曲線。

支鏈淀粉：取 1 mg/ml 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液 1ml， 放入 50ml 容量瓶中，以下操作同直鏈淀粉。在同一坐標(biāo)內(nèi)獲得支鏈淀粉可見光波段吸收曲線。

根據(jù)原理部分介紹的方法，確定直鏈淀粉和支鏈淀粉的測定波長、參比波長λ 2 、λ 1 、λ 4 和λ 3 。

2 .制作雙波長直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取 1mg/ml 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.3 、 0.5 、 0.7 、 0.9 、 1.1 、 1.3 ml 分別放入 6 只不同的 50ml 容量瓶中，加入蒸餾水 30ml ，以 0.1 mol/ L HCl 溶液調(diào)至 pH 3.5 左右，加入碘試劑 0.5 ml， 并用蒸餾水定容。靜置 20min， 以蒸餾水為空白，用 1cm 比色杯在λ 1、λ 2 兩波長下分別測定 A λ 1，A λ 2 即得△ A 直 = A λ1  - A λ 2 以△ A 直為縱坐標(biāo)，直鏈淀粉含量（mg ）為橫坐標(biāo)，制備雙波長直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 .制作雙波長支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取 1mg/ml 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液 2.0， 2.5 、 3.0 、 3.5 、 4.0 、 4.5 分別放入 6 只不同的 50ml 容量瓶中。以下操作同直鏈淀粉。以蒸餾水為空白，用 1cm 比色杯在λ 3 ，λ 4 兩波長下分別測定其 A λ 3，A λ 4 即得△ A 支 = A λ 4- A λ 3。以△ A 支為縱坐標(biāo)，支鏈淀粉含量（mg ）為橫坐標(biāo)，制備雙波長支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4. 樣品中一直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉的測定：樣品粉碎過 60 目篩，用Ether脫脂，稱取脫脂樣品 0.1g 左右（至 1mg ），置于 50ml容量瓶中。加 0.5 mol/ L KOH 溶液 10ml， 在沸水浴中加熱10min， 取出，以蒸餾水定容至 50ml 若有泡沫采用乙醇消除），靜置。吸取樣品液 2.5ml 兩份（即樣品測定液和空白液），均加蒸餾水 30ml， 以 0.1mol/LHCI 溶液調(diào)至 pH 3.5 左右，樣品中加入碘試劑 0.5ml， 空白液不加碘試劑，然后均定容至 50ml 。靜置 20min ，以樣品空白液為對照，用 1cm 比色杯，分別測定λ 2， λ 1， λ 4， λ 3 的吸收值 A λ 2， A λ 1， A λ 4， A λ 3。得到△ A 直 = A λ 2 - A λ 1 ，△ A 支=A λ 4-A λ 3 。 分別查兩類淀粉的雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出脫脂樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。二者之和等于總淀粉含量。

五、結(jié)果處理

式中， X1 一查雙波長直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液中直鏈淀粉含量（mg）

X2 一查雙波長支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液中支鏈淀粉含量（mg）

m 一樣品質(zhì)量 （g）

總淀粉（%）= 直鏈淀粉（%）+支鏈淀粉（%）

六、注意事項(xiàng)

因蠟質(zhì)和非蠟質(zhì)支鏈淀粉碘復(fù)合物顏色差異較大，在制備雙波長支鏈淀粉曲線時(shí)，應(yīng)根據(jù)測定的谷物類型選擇不同支鏈淀粉純品（蠟質(zhì)或非蠟質(zhì)型）。

七、思考題

1. 雙波長法測定谷物中直鏈、支鏈淀粉的原理是什么？

2. 除了雙波長法外，比色法（ 620nm ）和安培滴定法也能分別測定直鏈和支鏈淀粉。了解其原理，比較不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)。